ＰＣＲ及其改進(jìn)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
                                                                                                柳洪芳１，宋　慧２

                                               （１．黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院測試化驗(yàn)中心，黑龍江佳木斯１５４００７；２．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院）

摘要：簡述了ＰＣＲ及其幾種改進(jìn)技術(shù)，并對(duì)其在食品微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。
關(guān)鍵詞：ＰＣＲ改進(jìn)技術(shù)；食品微生物；檢測

     民以食為天，食以安為先。食品**是關(guān)系到人體健康和國計(jì)民生的重大問題。食品中的微生物是人類許多**發(fā)生的根源之一，隨著人們對(duì)食品**性認(rèn)識(shí)的不斷提高，傳統(tǒng)的微生物檢測方法因檢測成本高、速度慢、效率低等問題，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)快速檢測的要求。而ＰＣＲ及其改進(jìn)技術(shù)以其特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)在食品微生物檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

１　常規(guī)ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
　　多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ?。颍澹幔悖簦椋铮睿校茫遥┦牵保梗福的昝绹模耍粒遥佟。停眨蹋蹋桑拥热藙?chuàng)建的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或ＤＮＡ序列的方法，也稱基因的體外擴(kuò)增法，其擴(kuò)增過程包括以下３個(gè)步驟：①變性，即將模板雙鏈ＤＮＡ序列置于９５℃高溫下，使其變性解鏈成兩個(gè)單鏈模板。②退火，低溫（５０～６５℃）時(shí)，使人工合成的兩個(gè)引物與單鏈ＤＮＡ模板特異性地互補(bǔ)結(jié)合。③延伸，在適宜的溫度（７２℃）下，ＤＮＡ 聚合酶以單鏈ＤＮＡ 為模板，沿５，→３方向摻入核苷酸，使引物延伸合成模板的互補(bǔ)鏈，這就是新合成的ＤＮＡ雙鏈。新合成的ＤＮＡ雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板，繼續(xù)重復(fù)以上的ＤＮＡ多聚酶鏈反應(yīng)程序，就使得ＤＮＡ 片斷得到有效的擴(kuò)增。
     ＰＣＲ技術(shù)具有快速、靈敏、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，早在１９９２年ＮＡＫＡ?。剩桑停痢。龋郏保堇茫校茫曳椒▽?duì)病原菌進(jìn)行檢測，而利用ＰＣＲ技術(shù)檢測食品中病原微生物到近些年來才比較廣泛應(yīng)用。劉勝貴［２］等人利用ＰＣＲ技術(shù)檢測豬肉中沙門氏菌，對(duì)已知和未知被沙門氏菌污染的豬肉的培養(yǎng)物均能準(zhǔn)確檢測。對(duì)不同稀釋度的樣品進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，當(dāng)ＤＮＡ含量只有０．０１ｐｇ時(shí)，還能擴(kuò)增出條帶，說明該方法檢測豬肉中沙門氏菌具有特異性高且靈敏、快速等特點(diǎn)。巢國祥［３］等人通過ＰＣＲ法擴(kuò)增ｈｌｙ基因建立快速檢
測單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（Ｌｍ）的方法。并檢測模擬污染生豬肉、水和牛奶，檢測限達(dá)１０ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。該方法對(duì)Ｌｍ的鑒定具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快和易操作等優(yōu)點(diǎn)，可用于食品的Ｌｍ的分離檢測。

２?。校茫腋倪M(jìn)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
　　隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和各項(xiàng)新技術(shù)與ＰＣＲ技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，衍生出一些ＰＣＲ改進(jìn)技術(shù)。主要介紹實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ＩＭＳ－ＰＣＲ、ＤＧＧＥ－ＰＣＲ等４種ＰＣＲ改進(jìn)技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用。
２．１　實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ?。疲欤酰颍澹螅悖澹睿簦眩酰幔睿簦椋簦椋觯濉。校铮欤恚澹颍幔螅濉。茫瑁幔椋睢。遥澹幔悖簦椋铮睿┘夹g(shù)，是指在ＰＣＲ反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)ＰＣＲ進(jìn)程，*后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。此技術(shù)于１９９６年由美國Ａｐｐｌｉｅｄ?。拢椋铮螅螅簦澹恚蠊就瞥?，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了ＰＣＲ 從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)ＰＣＲ的快速、靈敏、操作方便等特點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：全封閉反應(yīng)，無需凝膠電泳等ＰＣＲ后處理，減小對(duì)環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作**；定量準(zhǔn)確；儀器在線實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀。該技術(shù)的諸多優(yōu)點(diǎn)使之在食品微生物的檢測中的應(yīng)用越來越廣泛。李光偉［４］等針對(duì)沙門氏菌ｆｉｍＹ 基因，設(shè)計(jì)特異引物和探針，建立了檢測食品中沙門菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ方法。其檢測靈敏度為１８０ｃｆｕ／ｍＬ，與國標(biāo)法檢出的陽性樣本數(shù)基本保持一致，準(zhǔn)確率達(dá)９９．７％。高虹［５］等建立了奶粉中阪崎腸桿菌ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。其所建立的方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，在２．２～５．４ｃｆｕ／ｌ００ｇ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；與ＦＤＡ方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)表明，兩種方法的檢測結(jié)果完全一致。翁文川［６］等人針對(duì)單增李斯特氏菌溶血素基因（ｈＩｙＡ），設(shè)計(jì)特異的引物ＴａｇＭａｎ探針，優(yōu)化體系，建立了食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的熒光定量ＰＣＲ檢測方法，該方法檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ，整個(gè)流程只需２７ｈ。與傳統(tǒng)方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果一致。Ｌｋｅｄａ［７］等根據(jù)金黃色葡萄球菌的ｓｅａ和ｎｕｃ基因設(shè)計(jì)引物，建立了脫脂奶粉中金黃色葡萄球菌的ＲＴＱ－ＰＣＲ檢測方法。
２．２　多重ＰＣＲ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
    多重ＰＣＲ是通過對(duì)普通ＰＣＲ技術(shù)的改進(jìn)而建立起來的一種技術(shù)，是將多條引物和多條模板混合在一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶，或者多條引物和單一的模板ＤＮＡ混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片斷，常用于對(duì)超長片斷的擴(kuò)增。與常規(guī)的ＰＣＲ相比，還具有擴(kuò)增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟(jì)簡便等特點(diǎn)，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測。梁會(huì)營［８］等根據(jù)阪崎腸桿菌外膜蛋白Ａ（ｏｍｐＡ）基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶（ｎｕｃ）基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，并優(yōu)化了ＰＣＲ的條件，建立了嬰幼兒奶粉中常見病原菌的多重ＰＣＲ檢測方法。結(jié)果表明，該方法具有很高的特異性，混菌檢測靈敏度達(dá)到１０３ｃｆｕ／ｍＬ，為快速檢測奶粉中病原菌提供了有效手段。陳偉［９］等對(duì)金黃葡萄球菌的ｎｕｃ基因、單增李斯特菌的ｈｌｖ基因和蠟樣芽孢桿菌的ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ基因設(shè)計(jì)了引物，建立了３種致病菌的多重ＰＣＲ檢測體系，結(jié)果顯示該方法檢測結(jié)果與單基因ＰＣＲ檢測的靈敏度相同，結(jié)果穩(wěn)定。整個(gè)檢測過程在１６ｈ內(nèi)完成，檢測靈敏度可達(dá)ｌｃｆｕ／ｍＬ。王艷君［１０］等人針對(duì)沙門氏菌編碼ＤＮＡ結(jié)合蛋白
的基因ｈｎｓ、大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７編碼外膜蛋白緊密素的基因ｅａｅＡ 和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌溶血素Ｏ基因Ｈｌｙ設(shè)計(jì)３對(duì)引物，建立同步檢測肉制品中３種致病菌的多重ＰＣＲ方法。通過對(duì)多重ＰＣＲ特異性和靈敏度進(jìn)行分析及對(duì)多重ＰＣＲ反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，該方法簡便、快速，可使混菌檢測靈敏度達(dá)到１０３ｃｆｕ／ｍＬ。ＫＡＷＡＳＡＫＩＳ［１１］等人利用多重ＰＣＲ方法同時(shí)檢測肉類中的沙門菌、李斯特菌和大腸桿菌Ｏ１５７∶Ｈ７，通過ＵＰＢ增菌培養(yǎng)基增菌后檢測敏感性可達(dá)到１ｃｆｕ／２５ｇ。

２．３?。桑停樱校茫壹夹g(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
**磁珠技術(shù)（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ?。簦澹悖瑁睿椋瘢酰澹螅┦牵玻笆兰o(jì)７０年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)新的**學(xué)檢測和分離技術(shù)。其原理是磁珠經(jīng)過一定的處理后，可結(jié)合某種微生物特異性抗體，形成**磁珠。將這種帶有特異性抗體的**磁珠加到待測樣品中，相應(yīng)的抗原物質(zhì)就會(huì)和**磁珠上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠**復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動(dòng)，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，從而達(dá)到快速分離抗原物質(zhì)的目的［１２］。該技術(shù)不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)
點(diǎn)以及**學(xué)反應(yīng)的高度特異性，還具有高效、快速、可重復(fù)性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)已在細(xì)胞分離和培養(yǎng)、生物大分子純化、**學(xué)及微生物學(xué)檢測等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)與ＰＣＲ結(jié)合，可大大縮短食品中致病菌檢測時(shí)間，同時(shí)也增加了檢測的特異性，克服ＰＣＲ檢測中易出現(xiàn)假陽性的弱點(diǎn)。近年來，ＩＭＳＰＣＲ技術(shù)已應(yīng)用于食品微生物的檢測中。李敏［１３］等研究表明，將ＩＭＳ與多重ＰＣＲ結(jié)合，２４ｈ內(nèi)即可檢出食品中的單增李斯特菌，*低檢測限可達(dá)１ｃｆｕ／２５ｇ（ｍＬ）。王曉聞［１４］等建立了沙門氏菌的磁捕獲－ＰＣＲ檢測方法，實(shí)驗(yàn)包括前增菌、**磁珠制備分離、ＤＮＡ提取及ＰＣＲ擴(kuò)增，７ｈ即可完成檢測過程，且檢測靈敏度為９ｃｆｕ／ｍＬ。結(jié)果表明該方法操作簡便、用時(shí)短、檢出率高。翁文川［１５］等應(yīng)用抗李氏菌**磁珠從增菌肉湯中篩選和富集目的菌。通過熒光ＰＣＲ技術(shù)檢測李氏菌溶血素ｈｌｙＡ基因，建立了單增李斯特氏菌的**磁分離－熒光ＰＣＲ方法。該方法檢測肉類制品中單增李斯特氏菌簡便易行，可在２７ｈ內(nèi)完成，特異性好，檢測低限為１ｃｆｕ／ｇ。

２．４　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術(shù)及其在食品微生物檢測中的應(yīng)用
ＰＣＲ－ＤＧＧＥ的技術(shù)是Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ等于１９８９年**提出的，將ＰＣＲ 和變性梯度凝膠電泳的（ＤＧＧＥ）分析技術(shù)結(jié)合起來是一種可將長度相同而序列不同的ＤＮＡ 片段混合物分離開的一項(xiàng)技術(shù)。ＤＧＧＥ的基本原理是：由于ＤＮＡ分子中４種堿基的組成和排列存在差異，造成不同序列的ＤＮＡ分子的解鏈溫度不同，解鏈時(shí)所需的變性劑
的濃度也不同。當(dāng)雙鏈ＤＮＡ 分子在含梯度變性劑（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，會(huì)致使序列不同的ＤＮＡ片段會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，從而使ＤＮＡ分子的遷移速度不斷下降，當(dāng)產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相對(duì)平衡時(shí)，不同序列的ＤＮＡ 片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細(xì)，有一個(gè)堿基差異的ＤＮＡ長段都可以被分開。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細(xì)菌、檢測時(shí)間短、檢測率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。近些年來，此技術(shù)在食品中檢測微生物后應(yīng)用也有報(bào)道。ＣＯＣＯＬＩＮ［１６］等建立一種直接檢測食品中李斯特菌屬的分子生物學(xué)方法。通過ＰＣＲ擴(kuò)增李斯特菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株的特異ｉａｐ基因，擴(kuò)增產(chǎn)物再用ＤＧＧＥ進(jìn)
行分離，鑒定出五種李斯特菌。李苗云［１７］等研究冷卻豬肉貯藏過程中的微生物變化，直接提取不同冷藏天數(shù)肉樣ＤＮＡ，對(duì)細(xì)菌１６ＳｒＤＮＡ的ｖ６－ｖ８區(qū)段進(jìn)行ＰＣＲ 擴(kuò)增，通過ＤＧＧＥ 及序列分析，結(jié)果表明，冷卻豬肉耗氧貯藏過程中的微生物主要有：熱殺索絲菌、莫拉氏菌、氣單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌和節(jié)桿菌，為快速檢測冷卻豬肉中的微生物污染提供新思路。
　　總之，由于ＰＣＲ及其改進(jìn)技術(shù)可以快速特異地?cái)U(kuò)增任何期望的ＤＮＡ 片斷和目的基因，使其在食品微生物檢測領(lǐng)域已有著實(shí)際的應(yīng)用。但在實(shí)際應(yīng)用中也表現(xiàn)出一些缺陷，例如由于引物之間的抑制或引物和其它模板間的非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性；實(shí)驗(yàn)條件不當(dāng)可能導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)生突變；引物設(shè)計(jì)及靶序列選擇不當(dāng)可能降低靈敏度和特異性等。盡管還存在著一定的問題，相信隨著ＰＣＲ及其改進(jìn)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和完善，ＰＣＲ及其改進(jìn)技術(shù)在食品微生物檢測領(lǐng)域會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更大的作用，必將把食品微生物檢測技術(shù)帶入一個(gè)新階段。