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技術(shù)文章

厭氧微生物的培養(yǎng)


實(shí)驗(yàn)原理

 

  
厭氧微生物在自然界分布廣泛,種類(lèi)繁多,作用也日益引起重視。培養(yǎng)厭氧微生物的技術(shù)關(guān)鍵是要使該類(lèi)微生物處于除去了氧或氧化還原勢(shì)低的環(huán)境中。
  
焦性沒(méi)食子酸與堿性溶液作用后,形成堿性沒(méi)食子酸鹽,在此反應(yīng)過(guò)程中能吸收氧氣而造成厭氧環(huán)境;牛肉渣內(nèi)既含有不飽和脂肪酸能吸收氧,又含有谷胱甘肽(glutathione)能形成負(fù)氧化還原電位差;厭氧罐是采用某種方法除去其中的氧,例如將鎂與氧化鋅制成產(chǎn)氫氣袋,放入罐中加水反應(yīng)產(chǎn)生氫,鈀或鉑是催化劑,在常溫下催化氫與氧化合成水,則可除去密封的厭氧罐中的氧。
 

 

實(shí)驗(yàn)試劑(厭氧微生物的培養(yǎng))

焦性沒(méi)食子酸,棉花,10%NaOH,**的石蠟凡士林(1∶1),牛肉,蛋白陳,葡萄糖, NaCl,肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

厭氧罐,催化劑袋,氣體發(fā)生袋,指示劑袋,**的帶橡皮塞或螺旋帽的大試管,**的玻璃板(直徑比培養(yǎng)皿大3—4 cm),**的滴管,燒瓶,刀等。

實(shí)驗(yàn)材料

巴氏芽孢梭菌(巴氏固氮梭狀芽孢桿菌,Clostridium pas- teurianum),熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens);

實(shí)驗(yàn)步驟(厭氧微生物的培養(yǎng))

 

  
1.焦性沒(méi)食子酸法
 ?。?)大管套小管法在大試管中放入少許棉花和焦性沒(méi)食子酸,焦性沒(méi)食子酸的用量按它在過(guò)量堿液中能每克吸收100ml空氣中的氧來(lái)估計(jì),本實(shí)驗(yàn)用量約0.5g。接種巴氏芽孢梭菌在小試管肉膏蛋白胨瓊脂斜面上,迅速滴入10%的NaOH于大試管中,使焦性沒(méi)食子酸潤(rùn)濕,并立即放入除掉棉塞已接種菌的小試管斜面(小試管口朝上),塞上橡皮塞或擰上螺旋帽,置30℃培養(yǎng)。
 ?。?)培養(yǎng)皿法取玻璃板一塊或用培養(yǎng)皿蓋,鋪上一薄層**脫脂棉,將1g焦性沒(méi)食子酸放于其上。用肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基倒平板,待凝固稍干燥后,在平板上一半劃線接種巴氏芽孢梭菌,下一半劃線接種熒光假單胞菌,并在皿底用記號(hào)筆作好標(biāo)記。滴加10%NaOH溶液約2ml于焦性沒(méi)食子酸上,切勿使溶液溢出棉花,立即將已接種的平板覆蓋于玻璃板上或培養(yǎng)皿蓋上,必須將脫脂棉全部罩住,焦性沒(méi)食子酸反應(yīng)物切勿與培養(yǎng)基表面接觸,以溶化的石蠟凡士林液(即vaspar)密封皿底與玻璃板或皿蓋的接觸處。置30℃溫箱培養(yǎng)。
  
2.皰肉培養(yǎng)基法
  (1)取已除去筋膜、脂肪的牛肉500g,切成小方塊,置1000ml蒸餾水中,以小火煮1小時(shí),用紗布過(guò)濾,擠干肉汁,將肉汁保留備用。再將肉渣用絞肉機(jī)絞碎,或用刀切碎,*好使其成細(xì)粒。
  (2)將保留的肉汁加蒸餾水,使總體積為2000ml,加入20g蛋白陳,2g葡萄糖,5gNaCl和絞碎的肉渣。置燒瓶中搖均勻,加熱使蛋白胨溶化。
 ?。?)取上層溶液調(diào)整pH為8.0,在燒瓶壁上用記號(hào)筆標(biāo)明瓶?jī)?nèi)液體高度,1.05kg/cm2,121.3℃**15分鐘后補(bǔ)足蒸發(fā)的水量,重新調(diào)整pH為8.0,再煮沸10—20分鐘,補(bǔ)足水量,再調(diào)整pH為7.4。
 ?。?)把燒瓶?jī)?nèi)容物搖勻,將溶液和肉渣分裝于小試管中, 用無(wú)菌手續(xù)加入已**的石蠟凡士林,以隔絕氧氣。
 ?。?)接種前可將上述已做好的庖肉培養(yǎng)基煮沸10分鐘,以除去溶入的氧,如果蓋有一層石蠟凡士林,需將石蠟凡士林先在火焰邊微加熱,使其溶化。在培養(yǎng)基手感不燙時(shí)按液體接種法接入巴氏芽孢梭菌,然后將接種的試管垂直,使石蠟凡士林凝固而密封培養(yǎng)基。再置30℃中培養(yǎng)。
  
3.厭氧罐培養(yǎng)法
  (1)用肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板,凝固干燥后,取兩個(gè)平板,每個(gè)平板一半邊劃線接種巴氏芽孢梭菌,另一半邊劃線接種熒光假單胞菌,并標(biāo)記好。取其中的一個(gè)已接種的平皿置于厭氧罐的培養(yǎng)皿支架上,而后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi);另一個(gè)已接種的平皿置培養(yǎng)室30℃培養(yǎng)。
 ?。?)剪開(kāi)催化劑袋,將催化劑倒入?yún)捬豕奚w下面的多孔催化劑盒內(nèi),擰緊催化劑盒的盒蓋。
 ?。?)剪開(kāi)氣體發(fā)生袋的切碎線處,并迅速將此氣體發(fā)生袋置罐內(nèi)金屬架的夾上,再向袋中加入約10 ml水。同時(shí),由另一人配合,剪開(kāi)指示劑袋,將指示條暴露,立即放進(jìn)罐內(nèi)。
  (4)迅速蓋好厭氧罐的蓋,將固定梁旋緊,置 30℃培養(yǎng)。
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