實(shí)驗(yàn)步驟

建議用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種：

1. 安瓶管開封

　(1). 用浸過70％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。

　(2). 用火焰將安瓿管頂端加熱。

　(3). 滴無菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開裂。

　(4). 用挫刀或鑷子敲下已開裂的安瓿管的頂端。

2. 菌株恢復(fù)培養(yǎng)

(1). 用無菌吸管，吸取0.3～0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基，滴人安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍于菌體溶解呈懸浮狀。

(2). 取0.1～0.2ml菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面／平板培養(yǎng)基上，剩余的菌液，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

(3). 若未能活化，或活化后有疑問時，請于收到菌種1個月內(nèi)，通知保藏中心，經(jīng)查證無誤后，即免費(fèi)補(bǔ)寄。

3. 注意事項

(1). 菌種活化前，請將安瓿管保存在6-10℃的環(huán)境下。

(2). ***的培養(yǎng)，如無特別說明，自開封至接種完成，均需以無氧氣體充填，以保持厭氧狀態(tài)。

(3). 某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后，延遲期較長，需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長，此時請將步驟2(2)重復(fù)一次。
 

冷凍干燥和液氮保藏菌種技術(shù)——液氮超低溫保藏程序：

1. 容器的選擇：使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。

2. 檢查安培瓶是否滲漏：用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶，其余的安培瓶備用。

3. 打印標(biāo)簽（激光打印）。

4. 容器的**：先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶，再用蒸餾水在**鍋中121℃浸泡**15分鐘，干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中，略擰緊螺旋蓋，再行121℃**30分鐘。

5. 保藏菌菌齡：處于*大生長量階段或?qū)?shù)生長期后期。

6. 保護(hù)劑：選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。

(1). 甘油的準(zhǔn)備：在121℃**15分鐘，2-8℃貯存。甘油一般以兩倍*終所需濃度的水溶液保存，然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液，則以*終所需濃度的水溶液保存。

(2). 二甲基亞砜：用0.22μm的聚四氟乙烯過濾膜過濾**。過濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。

7. 分裝：在無菌條件下，將細(xì)胞懸液（從平板上打下直徑為5cm的菌塊）分裝于安培瓶中，并注入保護(hù)劑，擰緊螺旋蓋。

8. 將安培瓶固定在鋁夾上，貼好標(biāo)簽。為了便于取用，一般一個鋁夾上僅放一個菌株。

9. 將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃，再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃，然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后，將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中保存。

10. 菌種的復(fù)活：將液氮保藏的菌種取出，迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘，等完全解凍后，再及時轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。